Năm 1991, siêu chiến binh James "Bucky" Barnes bị tẩy não và bị tra tấn tại một khu căn cứ của HYDRA tại Siberia để cử anh đi tấn công một chiếc xe vận chuyển mẫu huyết thanh siêu chiến binh. Ở thời điểm hiện tại, khoảng một năm sau sự thất bại của Ultron dưới tay Biệt đội Avengers tại Sokovia, Steve Rogers, Sam Wilson, Natasha Romanoff và Wanda Maximoff đã ngăn chặn một nhóm khủng bố do Brock Rumlow (Crossbones) cầm đầu nhằm ăn cắp vũ khí sinh học từ một phòng thí nghiệm ở Lagos, Nigeria. Sau khi bị đánh bại, Rumlow kích hoạt quả bom cảm tử trên người. Wanda vội đưa hắn vào một tòa nhà, nhưng vô tình giết chết một vài nhân viên cứu trợ của Wakanda trong tòa nhà đó.

Bộ trưởng Ngoại giao Hoa Kỳ Thaddeus "Thunderbolt" Ross thông báo với Biệt đội Avengers rằng Liên Hợp Quốc đang trong quá trình thông qua Hiệp định Sokovia, trong đó các siêu anh hùng phải đăng ký danh tính với chính phủ để chính phủ có thể theo dõi và điều chỉnh hoạt động của tất cả siêu anh hùng. Biệt đội Avengers chia ra làm hai luồng ý kiến: Tony Stark đồng ý với sự giám sát bởi vì anh cảm thấy có lỗi khi tạo ra Ultron, gây nên sự kiện kinh hoàng tại Sokovia khiến một thường dân thiệt mạng - hậu quả mà chính anh vừa mới biết, trong khi Rogers không tin tưởng chính phủ và mong muốn nhóm của anh vẫn có thể được tự do hành động. Chỉ riêng Wanda còn do dự. Trong lúc đó, Helmut Zemo, cựu chỉ huy tình báo Sokovia, theo dấu và sát hại kẻ đã kiểm soát Barnes ở căn cứ HYDRA, đánh cắp cuốn sách ghi chú mật mã kích hoạt quá trình tẩy não Chiến binh Mùa đông. Tại hội nghị ký kết Hiệp định diễn ra ở Vienna, một vụ đánh bom khủng bố đã giết chết Đức vua T'Chaka của Wakanda. Khi camera an ninh cho thấy thủ phạm là Barnes, con trai của T'Chaka là T'Challa thề sẽ trả thù cho cha mình. Bất chấp những lời khuyên của Romanoff, Rogers và Wilson quyết định theo dõi Barnes đến nơi ẩn náu của anh ở Bucharest và cố gắng bảo vệ anh khỏi lực lượng cảnh sát và T'Challa. Sau một cuộc rượt đuổi kéo dài, Barnes bị bắt giữ, còn Rogers, Wilson và T'Challa cũng bị bắt vì cản trở người thi hành công vụ.

Khi Barnes bị giam giữ ở Berlin, Zemo, với tư cách là người thẩm vấn Barnes, đã sử dụng mật mã kích hoạt của HYDRA, khiến cho Barnes phải phục tùng hắn. Rogers và Wilson đến để ngăn chặn và đưa Barnes đi. Sau khi tỉnh lại, Barnes nói với Rogers rằng Zemo muốn biết địa điểm của căn cứ HYDRA tại Siberia, nơi các Chiến binh Mùa đông khác (được tạo nên bằng các mẫu huyết thanh bị lấy cắp, mạnh hơn nhưng tâm lý bất ổn hơn Barnes) đang bị giam giữ. Nhằm bắt giữ Zemo, Rogers và Wilson tập hợp Wanda Maximoff, Clint Barton, và Scott Lang để giúp đỡ họ. Với sự đồng ý từ Ross, Stark tập hợp Romanoff, T'Challa, James Rhodes, Vision và Peter Parker để ngăn chặn nhóm của Rogers tại sân bay Leipzig/Halle. Một cuộc chiến nảy lửa giữa hai nhóm siêu anh hùng xảy ra sau đó, cho đến khi Romanoff để Rogers và Barnes chạy thoát bằng chiếc máy bay Quinjet, trong khi những người còn lại trong nhóm của Rogers bị đánh bại và bị giam giữ tại nhà tù Raft. Rhodes bị chấn thương cột sống nghiêm trọng dẫn đến liệt chân sau khi bị Vision bắn nhầm, còn Romanoff thì đã rời đi sau những lời chất vấn tính cách ích kỷ của Stark.

Zemo cố tình để lại những bằng chứng, kể cả thi thể của người thẩm vấn thực sự, nhằm tự thú mình là thủ phạm đánh bom tại Vienna và khống chế Barnes. Hay tin, Stark dùng chúng để thuyết phục Wilson cho anh biết vị trí hiện tại của Rogers. Stark đã đuổi theo Rogers và Barnes đến Siberia mà không hề báo lại với Ross, và anh cũng không hề hay biết rằng T'Challa đang bám theo mình. Họ phát hiện ra rằng những Chiến binh Mùa đông khác đã bị Zemo sát hại. Zemo cho Stark xem một đoạn video từ năm 1991, tiết lộ Barnes chính là tay sát thủ đã giết bố mẹ của Stark để ăn cắp mẫu huyết thanh siêu chiến binh trên xe của họ. Cảm thấy bị phản bội, Stark nổi điên lao vào đòi giết Barnes, còn Rogers thì cố gắng bảo vệ người bạn cũ dù đã không sớm kể chuyện này cho Stark biết. Barnes mất cánh tay máy của mình trong cuộc giao chiến, và Rogers vô hiệu hóa được bộ giáp Mark XLVI của Stark. Rogers dìu Barnes bỏ đi, và để lại chiếc khiên sau khi Stark cho rằng anh không xứng đáng với nó. Hài lòng khi đạt được mục đích trả thù cho cái chết của gia đình mình trong cuộc tấn công ở Sokovia bằng cách gây rạn nứt trong nội bộ Biệt đội Avengers, Zemo định tự kết liễu đời mình, nhưng T'Challa đã ngăn hắn lại và bắt hắn về giao cho chính phủ.

Sau này Stark cung cấp cho Rhodes một đôi chân máy để hồi phục chấn thương, còn Rogers thì đột nhập và giải cứu đồng đội của mình ra khỏi nhà tù Raft sau khi gửi cho Stark bưu phẩm chứa điện thoại liên lạc riêng và thư hòa giải kèm đề nghị làm ngơ cho mình. Trong phần cảnh hậu danh đề, Barnes đang ẩn thân tại Wakanda, và anh quyết định sẽ ngủ đông cho đến khi phương pháp chữa trị tẩy não được tìm ra. Trong phần cảnh hậu danh đề khác, Peter Parker trở về nhà tại Queens, New York và mày mò chiếc máy bắn tơ mà Stark chế tạo riêng cho anh.